巨噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)是機體免(mian)疫(yi)系統的重要(yao)細(xi)(xi)胞(bao)成分(fen)，具有(you)抗感染、抗腫瘤和參(can)與免(mian)疫(yi)應答(da)、免(mian)疫(yi)調(diao)節等生物(wu)學(xue)功能，是研究細(xi)(xi)胞(bao)吞噬(shi)、細(xi)(xi)胞(bao)免(mian)疫(yi)和炎癥的重要(yao)對象。

巨噬細胞的極化

　　巨(ju)噬細(xi)胞(bao)(bao)具有(you)異質性和(he)多樣性，可(ke)在(zai)不同的(de)組織微環境和(he)生理(li)病理(li)條件下(xia)，轉化(hua)為不同的(de)表型，稱為巨(ju)噬細(xi)胞(bao)(bao)的(de)極化(hua)。

　　巨噬細胞組織分布多樣(yang)性(xing)和異質性(xing)的特點(dian)，使之一直以來都(dou)是科研工作(zuo)者們(men)熱(re)門研究的對象。

　　根(gen)據細(xi)胞(bao)表面標記分(fen)子、細(xi)胞(bao)因子分(fen)泌及代謝(xie)相(xiang)關(guan)基因特征，巨噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)通常被(bei)分(fen)為經典活化的M1型巨噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)（促炎）和選擇性活化的M2型巨噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)（抗(kang)炎）。

　　■ M1型(xing)巨噬細胞表達(da)MHC II、CD80、CD86和 CD16/32，分泌(mi)TNF-α、IL-6和IL-12等促炎因子，以及(ji)CXCL9、CXCL10和CXCL11等趨化因子。

　　■ 另(ling)外，M2型巨噬細胞(bao)高(gao)表(biao)達(da)arginase-1(Arg1)和(he)CD206，分(fen)泌抗炎(yan)因子(zi)IL-10以(yi)及CCL2、CCL17和(he)CCL22等(deng)趨化因子(zi)。

　　巨噬細(xi)胞(bao)極化(hua)的(de)體外(wai)研究(jiu)，通常使用脂多糖（LPS）和干擾素（IFN-γ）等TLR激動劑誘導M1型極化(hua)，使用IL-4或(huo)IL-13等誘導M2型極化(hua)，然后記錄基因表(biao)達、細(xi)胞(bao)表(biao)面標志物及蛋(dan)白質含(han)量和活性的(de)變化(hua)。

　　原(yuan)代(dai)小(xiao)鼠巨噬細胞(bao)可(ke)以從多個(ge)部位獲得：比如骨髓(sui)、腹(fu)腔、肺或脂肪組織(zhi)等(deng)。目前巨噬細胞(bao)的分(fen)離的方法(fa)主要包括貼壁篩選法(fa)、密度梯(ti)度離心法(fa)、酶消(xiao)化(hua)法(fa)、流式細胞(bao)儀分(fen)離法(fa)等(deng)。

　　下(xia)面(mian)具體介(jie)紹小(xiao)鼠腹腔巨(ju)噬細胞和(he)骨髓來源巨(ju)噬細胞的提取和(he)分(fen)離。

腹腔巨噬細(xi)胞提取

　　巨噬(shi)細胞(bao)天然存在于小鼠腹(fu)(fu)腔(qiang)(qiang)，腹(fu)(fu)腔(qiang)(qiang)巨噬(shi)細胞(bao)多游離存在于腹(fu)(fu)水(shui)中(zhong)易(yi)于獲(huo)得：用生理鹽水(shui)或細胞(bao)培養基(ji)沖(chong)洗(xi)腹(fu)(fu)腔(qiang)(qiang)后抽取腹(fu)(fu)腔(qiang)(qiang)灌洗(xi)液體，即可獲(huo)取其中(zhong)的巨噬(shi)細胞(bao)。

　　以下(xia)為具體實驗方(fang)案：

（1）巨噬細胞(bao)的誘導

　　在實驗前3天，連續(xu)3天給小鼠(shu)腹腔注射1mL的3%巰基(ji)乙酸鹽肉湯，每天1次。（肉湯刺(ci)激(ji)是非感染性炎(yan)癥刺(ci)激(ji)，能(neng)促進巨噬細胞的聚集）

　　注(zhu)：

　　■ 腹腔注射是關鍵(jian)，給肉湯時記得回抽，切記不能刺到器官導致(zhi)小鼠腹腔出血(xue)，否則會使提取的巨(ju)噬細胞(bao)不純。

　　■ 硫乙醇酸鹽的作(zuo)用是將(jiang)巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞由(you)外周血中釋放入腹腔(qiang)中，可(ke)提取更(geng)多(duo)的巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞用于實驗(yan)，腹腔(qiang)巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞多(duo)為(wei)M1促炎型。

（2）3天后，收集巨噬細胞

　　① 處死小鼠

　　準備75%乙醇，小(xiao)鼠麻醉后，以脫頸方式(shi)處(chu)死(si)小(xiao)鼠，將小(xiao)鼠置于75%乙醇中浸(jin)泡3-5min進行滅菌消毒處(chu)理后（注：使小(xiao)鼠的(de)腹(fu)腔朝(chao)下浸(jin)沒在酒(jiu)精(jing)中），移入超凈臺(tai)，仰臥位固定(ding)小(xiao)鼠。

　　② 暴露腹(fu)膜

　　將(jiang)小鼠外(wai)皮拉起，沿(yan)腹(fu)部(bu)剪開一個小口（注意勿將(jiang)腹(fu)膜剪破），再剪開整個腹(fu)部(bu)皮膚，捏住兩(liang)(liang)側皮膚慢(man)慢(man)向兩(liang)(liang)邊撕開，使腹(fu)膜暴(bao)露。

　　③ 向腹腔注射(she)生理鹽水(shui)或細胞培養(yang)基：

　　于右下腹(fu)部(bu)將5mL預(yu)冷(leng)的(de)PBS（或(huo)5mL預(yu)冷(leng)的(de)10%血清RPMI-1640培(pei)養液）緩緩注入(ru)腹(fu)腔（注意不(bu)要(yao)抽(chou)進空氣(qi)），輕揉(rou)小鼠腹(fu)部(bu)數次，靜置3-5min，使液體在腹(fu)腔內充分流動。

　　注(zhu)：

　　■ 腹腔注射(she)直接會接觸表皮，易污染，此步驟(zou)需要多(duo)加注意。

　　■ 腹腔(qiang)注射培養基(ji)后，按壓動作要輕柔緩慢，以防培養基(ji)從針孔溢出。

　　④ 抽取腹腔(qiang)液，轉移至離(li)心管中（反復沖(chong)洗腹膜腔(qiang)灌洗液2次）。

（3）巨(ju)噬細(xi)胞的(de)純(chun)化與培養

　　將(jiang)收集的腹(fu)腔(qiang)灌洗液于常溫條件下(xia)1000r /min 離心(xin)5min，棄去(qu)上清，所得細(xi)胞沉淀用RPMI-1640培(pei)養液重懸(xuan)接種，培(pei)養體系(xi)于37℃靜置培(pei)養2～3h后，洗去(qu)未貼壁細(xi)胞，余下(xia)的貼壁細(xi)胞即為巨(ju)噬細(xi)胞。

　　注(zhu)：由(you)于腹腔巨噬細胞的粘附能力不強(qiang)，清洗的時候動作(zuo)要(yao)盡(jin)可能輕。

注意事項

　　■ 小鼠(shu)腹(fu)腔(qiang)注射(she)刺激物時不要刺破內(nei)臟，可以在操作過程中將(jiang)小鼠(shu)頭部向(xiang)(xiang)下抓取，使其腹(fu)部內(nei)容物滑(hua)向(xiang)(xiang)膈下以避(bi)開(kai)注射(she)器針頭；

　　■ 若(ruo)回收的(de)小(xiao)鼠(shu)腹腔灌洗液(ye)過(guo)少(shao)，可另外注入預(yu)冷的(de)PBS重復灌洗；

　　■ 若不小(xiao)心致腹腔(qiang)出(chu)血(xue)，可在腹腔(qiang)液(ye)離(li)心后(hou)重懸時加入(ru)5倍細(xi)胞懸液(ye)體(ti)積的紅(hong)細(xi)胞裂解液(ye)，再次離(li)心棄上層紅(hong)色液(ye)體(ti)。

　　■ 盡量避免(mian)被小鼠咬傷(shang)或(huo)(huo)吸過小鼠腹腔(qiang)液的針頭扎傷(shang)，一旦被咬傷(shang)或(huo)(huo)扎傷(shang)，要到專門機構盡快注射(she)出(chu)血熱(re)疫(yi)苗(miao)，如果創面(mian)大，需(xu)同(tong)時(shi)注射(she)破(po)傷(shang)風疫(yi)苗(miao)。

骨(gu)髓來源巨噬細胞的(de)提取(qu)

　　在(zai)原代巨(ju)噬(shi)(shi)細胞(bao)的(de)(de)獲取中，直(zhi)接分(fen)離(li)(li)的(de)(de)腹腔巨(ju)噬(shi)(shi)細胞(bao)（或者肺泡巨(ju)噬(shi)(shi)細胞(bao)）數量有限，在(zai)未經誘導(dao)(dao)時，每只(zhi)小鼠(shu)只(zhi)能獲取1.5-3×106個腹腔巨(ju)噬(shi)(shi)細胞(bao)，不能滿足某些實驗的(de)(de)需求，因此骨髓誘導(dao)(dao)分(fen)化(hua)的(de)(de)巨(ju)噬(shi)(shi)細胞(bao)（Bone marrow-derived macrophages，BMDM）是目前(qian)實驗室常(chang)用的(de)(de)分(fen)離(li)(li)小鼠(shu)巨(ju)噬(shi)(shi)細胞(bao)的(de)(de)選擇。

　　以下為(wei)具體實(shi)驗方案：

（1）誘導因子的獲取

　　M-CSF是一種(zhong)誘導骨髓(sui)細胞向M2型巨(ju)噬細胞分化的誘導因(yin)子，獲取(qu)的途徑有兩種(zhong)：

　　1）找商業化的細(xi)(xi)胞因(yin)子(zi)產品直接購買，但(dan)不同廠家(jia)的細(xi)(xi)胞因(yin)子(zi)活性差異較大，需仔(zi)細(xi)(xi)甄別。M-CSF的使(shi)用(yong)濃度在20-50ng/mL即可。

　　2）自己培養能夠(gou)分(fen)泌這種細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子的細(xi)胞(bao)，其中L929細(xi)胞(bao)上(shang)清(qing)含有較高活(huo)性M-GSF以及其它(ta)多種細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子，比如VEGF、MCP-1、MIG、IL-9/10等。該培養體系可以在(zai)短(duan)時間內獲得(de)大量巨(ju)噬細(xi)胞(bao)樣的細(xi)胞(bao)，并且(qie)該體系不適合其它(ta)細(xi)胞(bao)生長，因(yin)(yin)而其它(ta)各系細(xi)胞(bao)會逐步死(si)亡，經(jing)換液去除懸浮細(xi)胞(bao)后，最終可以獲得(de)大量純化的骨(gu)髓巨(ju)噬細(xi)胞(bao)樣細(xi)胞(bao)。

（2）骨髓巨噬(shi)細胞的分離

　　1）取(qu)腿骨(gu)

　　準(zhun)備75%乙(yi)(yi)醇，小鼠麻(ma)醉(zui)后(hou)，脊(ji)髓(sui)脫臼法(fa)處死(si)小鼠，將小鼠置于75%乙(yi)(yi)醇中浸泡(pao)5min進(jin)行滅菌消毒(du)處理；

　　轉(zhuan)移到超凈工(gong)作臺，固定小鼠(shu)上肢，用剪刀(dao)從腹部中線剪開(kai)，取其雙側(ce)股骨(gu)和脛(jing)骨(gu)，剔除骨(gu)上附著的肌(ji)肉和組織(zhi)（注意：應盡量將肌(ji)肉組織(zhi)去(qu)除，只留(liu)下骨(gu)頭，整個過(guo)程務必保持股骨(gu)及脛(jing)骨(gu)的完整性(xing)！）

　　將(jiang)去(qu)皮去(qu)肉的股骨(gu)、脛骨(gu)放置在含有(you)75%乙(yi)(yi)醇(chun)的培養皿內(nei)浸(jin)泡(pao)5min（注：75%乙(yi)(yi)醇(chun)對骨(gu)髓細(xi)胞沒有(you)影響，但(dan)盡量要控制在5 min之(zhi)內(nei)），然后用冷(leng)的PBS浸(jin)泡(pao)，洗去(qu)脛骨(gu)、股骨(gu)表面的乙(yi)(yi)醇(chun)，5min。

　　2）骨髓巨噬細胞提取和誘導

　　將(jiang)清洗好的(de)股(gu)骨(gu)、脛骨(gu)分(fen)開，并用剪刀分(fen)別將(jiang)股(gu)骨(gu)、脛骨(gu)兩端剪斷，使用1-2mL注(zhu)射器吸(xi)取冷的(de)誘(you)導培養基將(jiang)骨(gu)髓從股(gu)骨(gu)、脛骨(gu)中吹出，反復吹洗3次，直至(zhi)骨(gu)內看不到明顯的(de)紅(hong)色為(wei)止。

　　此時可能會有(you)紅色條(tiao)狀物質，這是(shi)聚集的骨(gu)(gu)髓細胞(bao)(bao)，用5mL移(yi)液槍(qiang)將(jiang)含有(you)骨(gu)(gu)髓細胞(bao)(bao)的培養基反(fan)復吹打，將(jiang)塊狀的細胞(bao)(bao)團吹散。

　　然后使用70μm細胞(bao)濾器(qi)將細胞(bao)過篩，轉(zhuan)移至15mL離心管中，1500rpm/min離心5min，棄(qi)上清(qing)。

　　加入(ru)紅(hong)細(xi)胞(bao)裂解液重(zhong)懸，輕彈管底，混懸細(xi)胞(bao)沉淀，靜置(zhi)5min后，加入(ru)10 mL 冰PBS進行洗滌(di)，4°C，1500rpm/min離心5min，棄上清(qing)（必要時重(zhong)復(fu)，直至細(xi)胞(bao)團塊紅(hong)色部(bu)分明顯減少(shao)），用冷(leng)的配置(zhi)好(hao)的骨髓(sui)巨噬細(xi)胞(bao)誘(you)導培養基重(zhong)懸，鋪板。

　　細胞(bao)培(pei)養期(qi)間，每(mei)隔2-3天(tian)更(geng)換新鮮(xian)骨髓來(lai)源巨噬(shi)細胞(bao)培(pei)養基(ji)，加入(ru)培(pei)養基(ji)前用PBS清(qing)洗細胞(bao)，培(pei)養7天(tian)后(hou)收(shou)集細胞(bao)。

注意事項：

　　■ 骨髓巨(ju)噬(shi)細胞不可傳(chuan)代(dai)，不可以用(yong)胰酶(mei)消化，使用(yong)時可用(yong)細胞刮(gua)直接刮(gua)下來(lai)或者用(yong)槍吹(chui)打下來(lai)，然后離心計數即(ji)可用(yong)于實驗。

　　■ 建(jian)議直接鋪板用(yong)于(yu)后續實驗，更(geng)換培(pei)養容器會損傷細胞。

　　■ 細胞(bao)誘導成功后(hou)要及(ji)時(shi)(shi)使用，不宜長(chang)時(shi)(shi)間(jian)培(pei)養(yang)。

對于(yu)體內巨噬細胞(bao)(bao)的(de)(de)研究(jiu)，一個重要的(de)(de)方法就是使(shi)用荷蘭Liposoma公司的(de)(de)Clodronateliposomes氯膦酸(suan)二(er)鈉(na)脂(zhi)質體清除單(dan)核巨噬細胞(bao)(bao)。訂購(gou)前建議(yi)聯系靶點(dian)科技(ji)(ji)，給(gei)出(chu)建議(yi)后，再聯系靶點(dian)科技(ji)(ji)訂購(gou)現貨。